Белки - это цепочки аминокислот, выполняющие множество функций, важнейшая из которых - ферментативная, то есть регуляция химических реакций в живых организмах.
В основе жизнедеятельности любого организма лежат химические процессы. В каждой клетке вашего тела происходят тысячи химических реакций, и совокупность этих реакций определяет вашу индивидуальность. В этой грандиозной химической системе важнейшую роль играют молекулы белков.
Они распознают различные белки мочи достаточно точно и количественно, за исключением небольших фрагментов белка. Электрофоретические методы также количественно косвенны с помощью денситометрического интегрирования: результаты различных фракций или полос выражены в процентах от общей протеинурии. Что касается методов будущего, то капиллярный электрофорез, который является очень решительным, представляется многообещающим, но в настоящее время он не применим к мочи. Тем не менее, нет консенсуса относительно уровня концентрации, который должен быть достигнут у субъектов с миеломой.
Давайте в начале нашей беседы о белках поговорим об их строении. При конструировании сложных молекул вы можете пойти двум путями: либо использовать систему модулей и собирать всевозможные крупные молекулы из небольшого числа структурных единиц, либо изготавливать каждую молекулу по индивидуальному плану. Вспомните старые и новые методы строительства. Раньше все элементы конструкции изготавливали только для одного здания, и в других зданиях они не встречались. В наше время такие здания (если их только можно отреставрировать) считаются очень красивыми и ценятся выше современных построек. Современный же метод строительства состоит в том, чтобы взять уже готовые однотипные детали, или модули (кирпичи, окна, двери), и собрать из них здание. Но и в такой системе, компонуя серийные детали по-разному, можно построить самые разнообразные сооружения. Аналогичный подход реализуется в живых системах - структурная сложность достигается за счет модульного принципа построения. Именно такой подход логичен с точки зрения теории эволюции, поскольку он позволяет последовательно усложнять структуры по мере появления новых модулей.
Разделение белка происходит в щелочном буфере с пятью классическими фракциями: альбумином, альфа1, альфа2, бета и гамма. После окрашивания амидошварцем интеграция осуществляется путем денситометрии. Необходимо параллельно вводить образец нормальной сыворотки, чтобы правильно позиционировать слайдеры интеграции, часто трудно размещать на электрофореграмме с мочой. Гели обязательно хранятся при комнатной температуре в оригинальной сумке. Анализ мочи электрофорезом особенно важен при множественной миеломе, где он обязательно дополняет анализ сыворотки, особенно когда он мало или вообще не имеет информации.
Основной структурной единицей белков являются аминокислоты. Молекулы этого класса имеют сходную структуру, немного различаясь в деталях. Они представляют собой цепочку атомов, на одном конце которой находится положительно заряженный ион водорода (Н+), а на другом - отрицательно заряженная гидроксильная группа (ОН–), состоящая из кислорода и водорода. От основной цепи ответвляются боковые группы, различные для разных аминокислот. В живых организмах насчитывается 21 аминокислота.
Значительное практическое преимущество для лабораторий, выполняющих лишь небольшое количество электрофореза в моче, для анализа мочи и сывороток требуется только один тип геля. С другой стороны, многие недостатки ограничивают интерес этого подхода для лабораторий, регулярно занимающихся электрохимическими мочи. В дополнение к проблеме низкой чувствительности, часто трудно вводить почечную протеинурию с этим типом геля. Кроме того, стоимость обычных технологий высока из-за покупки дорогостоящих концентраторов.
На техническом уровне концентрация образцов мочи иногда длительна с потенциальной потерей небольших белков. Типированию протеинурии иногда препятствует миграция нескольких белков в бета-зоне: свободные легкие цепи, целые иммуноглобулины, гемоглобин и трансферрин. Наконец, моноклональные свободные легкие цепи, миграция которых идет от зоны гамма-зоны в зону альфа2, нельзя отличить от целых иммуноглобулинов, имеющих соседний электрический заряд. Чувствительные методы. Сравнительно недавний маркетинг производителями реагентов агарозы с высокой степенью растворения гелей или молекулярным ситом сегодня позволяет преодолеть утомительный и дорогой шаг концентрации образцов.
Из аминокислот строится белок. Этот процесс напоминает нанизывание бусинок на нить. При сближении двух аминокислот ион водорода (Н+) одной из них соединяется с ОН–-группой второй, и две аминокислоты связываются друг с другом с высвобождением молекулы воды. При этом возможны самые разные сочетания аминокислот. Последовательность аминокислот в «бусах» называется первичной структурой белка. Поскольку бусиной может быть любая из 21 аминокислоты, то даже для коротких белков существует огромное количество возможных вариантов первичной структуры. Например, существует более 10 триллионов способов собрать белок длиной всего в 10 аминокислот!
Эти чувствительные гели были предметом недавнего исследования валидации для типирования протеинурии. Снижение порога обнаружения по сравнению с обычными гелями является важным моментом для анализа образцов у пациентов с ранней или проходящей моноклональной гаммопатией. Электрофоретическое фракционирование с высоким разрешением позволяет получать около десяти полос, распределенных между зоной альбумина и гамма-глобулинами. Основная цель этого типа геля - выделить моноклональные легкие цепи или иммуноглобулины в моче с высокой чувствительностью.
После того как определена первичная структура белка, под действием электростатических взаимодействий между различными боковыми группами аминокислот, а также между аминокислотами и окружающей их водой белок принимает сложную трехмерную форму. Для нас важнее всего белки, которые сворачиваются в сложные сферические структуры, поскольку именно они регулируют химические реакции в живых организмах. (Другие типы белков, например те, из которых состоят волосы и прочие структуры тела, имеют не такую форму.)
Подозрительные полоски, обнаруженные в гамма, бета или альфа 2, должны быть подтверждены иммунофиксацией, если пациент не известен. Со своей стороны, мы считаем, что недостатки, встречающиеся при использовании обычных гелей, усиливаются этим типом техники из-за увеличения числа полос, присутствующих на геле.
Разделение в соответствии с молекулярной массой. Основные характеристики этого геля суммированы в таблице 3 и были предметом детального изучения. В этом техническом подходе образцы мочи предварительно обрабатываются додецилсульфатом натрия, сильно анионным детергентом. Основное аналитическое преимущество по сравнению с традиционными методами, чувствительность геля позволяет осаждать образцы мочи без предварительной концентрации. Основным недостатком этого типа техники является необходимость деполимеризации димеров или полимеров легкой цепи, присутствующих примерно в 50% образцов мочи, содержащих моноклональные свободные легкие цепи.
При взаимодействии сложных молекул между определенными атомами каждой из молекул образуется химическая связь. Одной лишь способности молекул к взаимодействию недостаточно для образования связи. Две молекулы должны сблизиться и принять такую ориентацию, при которой атомы, способные образовывать химические связи, могли бы состыковаться, как космические корабли на орбите. Поэтому трехмерная структура имеет первостепенное значение для химических процессов, идущих в живых организмах.
Восстановительную обработку проводят бета-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом. Пять микролитров этого раствора добавляют к 100 мкл мочи и оставляют при контакте в течение 5 минут. Следует отметить, что небольшая часть полимеров легкой цепи иногда устойчива к уменьшению обработки. Со своей стороны, мы включаем в каждую серию контроль деполимеризации для проверки качества восстановительной обработки. Он состоит из мочи, выбранной для ее высокой доли полимеризованных свободных моноклональных цепей. Действительно, фундаментально получить идеальную и равномерную сушку геля перед стадией окрашивания, в противном случае получить области, которые трудно обесцвечивать и могут препятствовать денситометрическому интегрированию.
Трудно поверить, чтобы две сложные молекулы, предоставленные сами себе, случайным образом расположились бы в пространстве так, чтобы стало возможным их взаимодействие. Для протекания химической реакции с заметной скоростью необходимо участие молекул, называемых ферментами (см. Катализаторы и ферменты). Фермент притягивает обе молекулы к себе и придает им ориентацию, обеспечивающую взаимодействие. Как только взаимодействие произошло, фермент, выполнивший свою работу, высвобождается и может повторить эту операцию со следующей парой молекул.
То же самое происходит после этапа фиксации. В дополнение к простому и быстрому визуальному набору протеинурии этот гель позволяет обнаруживать свободные легкие цепи и их достоверную количественную оценку с помощью денситометрии. Некоторые примеры электроферограмм, характерных для различных типов протеинурии, представлены на рисунке 4. Тем не менее важно подчеркнуть, что оценка способа поликлонального или моноклонального характера свободных легких цепей невозможна с помощью этого типа техники. Поэтому использование иммунофиксации является обязательным для утверждения моноклональности, если пациент не известен.
Благодаря своей сложной структуре белки идеально справляются с ролью ферментов. Каждой первичной структуре соответствует определенная форма молекулы белка и, следовательно, определенная химическая реакция, которую этот белок катализирует. Во всех живых организмах первичная структура белка записана на молекуле ДНК (см. Центральная догма молекулярной биологии). Таким образом, ДНК держит под контролем весь организм, определяя спектр образующихся белков и, таким образом, возможные химические реакции.
На практике, однако, наличие моноклональных легких цепей легко дифференцируется от поликлональных белков, встречающихся в основном в присутствии трубчатой или смешанной протеинурии. В этих случаях полоса, соответствующая легким цепям, не больше, чем у других микропротеинов. Критерии предотвращения путаницы с моноклональным свободным профилем перегрузки легкой цепи: менее ориентированный аспект полосы легкой цепи, меньшее значение перегрузки, поликлональный аспект гамма-глобулинов. соответствующей сыворотке и, конечно, клинический контекст.
В принципе, по первичной структуре белка можно было бы предсказать, какую форму будет иметь его молекула, а значит, предсказать и природу химической реакции, в которой этот белок будет участвовать. В действительности же эта проблема укладки белка настолько сложна, что пока ее невозможно вычислить даже при помощи лучших компьютеров и программного обеспечения. На сегодняшний день это одна из основных нерешенных проблем молекулярной биологии.
Невозможно путать с легкими цепями, о чем уже сообщалось при обычных электрофоретических методах. Для идентификации моноклональных легких цепей метод иммунофиксации в значительной степени превалировал над иммуноэлектрофорезом, который длиннее и труднее интерпретировать. Образец осаждается на нескольких параллельных дорожках с использованием маски осаждения. После электрофоретической миграции антитела сразу же осаждаются с использованием маски осаждения на разных дорожках, за исключением ссылки. Антитела легко диффундируют в агарозном геле из-за его высокой пористости.
Список литературы
Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://elementy.ru/